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病毒序列测定及亲缘关系比对操作指南--SWINE CLUB连载-4

VETMOOC2019-01-11 04:48:35

Tip:

 1、基因测序可确诊,可排除污染;

 2、测序和序列比对可用于确定毒株种类和亲缘关系;

 3Life isdigitalLife is ATCG.

在前一期病原学检测技术的推文中介绍过PCR检测是确定病原的利器,但是PCR出现阳性条带有可能是非特异的扩增,需要测序验证;基因测序可确诊,可排除污染;但更重要的是测序和序列比对可以用于确定毒株种类和亲缘关系。这里先不谈当前火热的NGS(next generation sequencing,深度测序)用于诊断的打法,仅仅介绍常规PCR后的直接测序或克隆测序。

测序方法主要用的是化学裂解法(MAxam-Gillber法)--基本不用了


和DNA链的末端合成终止法(Sanger法)。它是利用双脱氧核糖核酸(ddA,ddT,ddC和ddG)加到DNA链之后会终止延伸的特性,根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见DNA碱基序列的一种方法

该方法通过优化后,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。DNA自动测序仪可用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸,然后进行Sanger测序反应,反应产物经电泳(平板电泳或毛细管电泳)分离后,通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光,检测器采集荧光信号,并依此确定DNA碱基的排列顺序。


说了那么多,其实现在实验室的小伙和丫头们基本就是打个电话让测序公司的小哥来冰箱里取样品(一般都是PCR产物)公司会负责跑胶鉴定和回收测序。快的第二天就把序列发邮箱了。


测序结果回来后具体怎么分析病毒的亲缘关系,我们实验室检测小组的组长张心慧同学写了一个详细的操作protocol,做了一些编辑修改分享如下:

现有的序列分析软件有很多种,常用的是Chromas2软件和DNASTAR软件包。 Chromas2 用于查看测序峰图,判断测序质量,和截取有效序列段;而DNASTAR其分为GeneQuest、Editseq、Megalign、SeqMan等多个软件,在对检测结果的对比序列过程中常用Editseq、Megalign两个软件。


 下面使用带入式情境描述一下序列分析和比对的过程:

 

通常将样品送到测序公司几天后会收到测序结果如图:

 

下载邮件中的附件

解压后会发现一份送检样品会有两种格式的文件

                             


AB1后缀文件是测序结果的峰图,可以用Chromas2软件打开,通过峰图来得知测序结果的准确性,和准确区域


一般是方法一、方法二结合使用,通常情况下,测序结果头尾峰图很乱,序列不准确,在序列对比的过程中我们一般要先截去测序结果的首尾序列段,再进行分析。当做PCR测序的时候需要流出足够的flank序列这样把PCR片段设计的比真实需要测序的片段大,这样保证能够获得足够的完整基因序列。如果PCR产物克隆到载体上之后,通过载体上通用引物测序,可以保证前面不准的区域都是载体序列,到插入序列的时候已经是整齐的峰图了,不影响测序结果。

 

SEQ文件我们通常用Ediseq打开,可以看到测序结果且可以进行进一步编辑操作。


我们根据峰图的结果将首尾不稳定段在SEQ文件中删除,保存编辑后的文件(掐头去尾,根据峰图整齐度来选择截掉的序列)

                                  

                      取个名字保存文件。 

保存到自己方便找到的位置。

将测序结果处理完后用Megalign软件和和国内已有的代表性毒株进行核酸相似性比对。



将代表毒株和测序结果的SEQ文件拖进MegAlign软件中,上下拖拽可以调整序列排列顺序。


选择“Align”> "By Clustal W Method"    (Clustal W 比对时间更长,更精准);如果是要看氨基酸序列的同源性,可以先将核苷酸序列翻译成蛋白质再比对,前提是核苷酸序列是按正确的3个碱基3个碱基排列的,且以密码子的第一位开头的,否则会移码导致无法翻译或提前终止。

                 

软件开始自动一一比对,序列的长短、数量和电脑配置将决定多久能搞定。


比对完毕之后,选择“View”>“Sequence Distance”来呈现序列间的同源性。

得出比对结果如下,已PRRSV的ORF5测序为例。


比完之后做一个表统计亲缘性。

从PRRSV 测序结果与参考毒株序列的比对能大致看出毒株的来源。一般PRRSV测序时选取的参考毒株应该包括北美原型株VR-2332,国内经典株CH1-a,HP-PRRSV毒株JXA1(JXwn06,HuN4都行),HP-PRRSV 来源的MLV JXA1-R(P80), NADC30(or NADC30-like)毒株CHsx1401和新近流行的QYYZ和GM2。欧洲型毒株LV的话,如果和美洲型亲缘性极低的时候再比。


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